免疫印迹（Western blot，WB）是蛋白组学中检测复杂生物提取物中特定蛋白质存在的方法之一。其过程先要进行SDS-PAGE，然后将分离的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后，利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品。   由于WB实验实验流程长、涉及步骤多、操作细节要求高，经常会出现一些NG的情况让WB新手摸不着头脑。为了帮助大家更好地完成WB实验，我们给大家整理了一些WB中常见的问题，并让技术老师给参考处理办法，帮助大家解决实验问题，实验顺顺顺！   一、蛋白电泳条带异常   1.“微笑”条带 原因：凝胶不充分；电压过高；温度过高；电泳速度过快 建议：待充分凝胶后再电泳；降低电压；低温电泳；减慢电泳速度 2.“皱眉”条带 原因：凝胶与玻璃挡板质之间有气泡 建议：在两板间加入适量缓冲液以排除气泡 3.条带拖尾 原因：凝胶浓度过高；电泳缓冲液失效；蛋白降解 建议：重新配制电泳缓冲液；降低凝胶浓度； 4.垂直纹理 原因：样品裂解不充分；样品有不溶性颗粒；蛋白降解 建议：加样前离心样品；优化蛋白提取方法，寻找合适裂解液 5.条带模糊 原因：蛋白未完全变性；电泳太快；转膜问题 建议：完全变性蛋白样品、降低电泳时间、电泳之后及时将凝胶浸泡在转膜液中   二、转膜不成功   6.膜上无大分子条带 原因：转膜时间短；蛋白太大转不过 建议：转膜条件（延长时间）、选择湿转（半干转不适合大分子条带）、选择NC膜，降低凝胶浓度 7.膜上无小分子条带 原因：膜孔径大于蛋白，转膜时间过长 建议：减少转膜时间，选择PVDF膜 8.膜上无条带 原因：操作原因；膜的选择不适合，蛋白与膜的结合能力弱 建议：检查转膜条件、选取合适的膜 9.蛋白条带转到滤纸上 原因：电压过高；时间过长；膜的孔径太大 建议：降低电压，减少转膜时间；选择合适的膜   三、信号强度低   信号强度低是指在正常曝光条件下得到的目的条带微小或是没有目的条带，而增加曝光时间又会招致背景高、杂带多等问题。扫除试剂质量、操作失误等方面的影响，这一类问题产生的主要缘由如下： 10.样本蛋白表达量缺乏 倡议添加蛋白表达量较高的细胞系作为阳性对照，或是恰当增加上样量以取得较高程度的信号； 11.蛋白质降解 在蛋白样品制备期间留意蛋白酶抑止剂 PMSF 的运用，所制备的样品尽快检测或妥善保管； 12.蛋白的转膜 运用恰当孔径的膜，同时优化转膜时间，关于高分子量蛋白可能需求更长的转膜时间； 13.抗体的运用 确保抗体的反应种属与实验类型需求可以满足实验的需求，此外，抗体的稀释比、孵育时间等问题也需求在实验中不时优化； 14.蛋白与抗体分离率低 减少洗膜次数或缩短洗膜时间，降低洗膜液中 NaCl 浓度等； 15.抗原被封锁液遮盖 换用不同的封锁液，优化封锁液中蛋白质浓度并缩短封锁时间； 16.甲醇浓度过高 会招致蛋白质与 SDS 别离，并沉淀在凝胶中，同时使凝胶收缩或变硬，从而抑止高分子量蛋白的转移。实验中可恰当降低甲醇浓度或者运用乙醇、异丙醇替代。   四、非特异性条带或条带位置不对   WB 结果中目的条带之外的条带被称为非特异性条带，有时非特异性条带很明显，却没有目的条带，这些状况对结果剖析会产生很大的干扰。一般来说，引起这类问题的主要要素有： 17.抗体的非特异性分离 通常以为，多抗的特异性不如单抗，更容易产生非特异性条带，而恰当降低抗体的浓度有助于减少杂带。同时为了扫除二抗非特异性分离的可能，倡议设二抗阴性对照； 18.样品蛋白量过高 恰当降低上样量，同时延长洗濯时间与封锁时间可防止蛋白量过高对实验结果的不良影响； 19.蛋白质降解 会招致条带位置变化并产生更多杂带，倡议采用新颖制备的或是冻融次数较少的样品； 20.细胞传代次数过多 会招致蛋白表达形式的分化，倡议运用原始或传代少的细胞株； 21.蛋白存在复合物 有的目的蛋白会和其他蛋白分离构成复合物，招致条带位置改动，需求查阅相关文献来肯定蛋白能否会构成稳定复合物； 22.蛋白存在剪接体或多种修饰方式 局部蛋白存在剪切位点，有的剪切体具有免疫活性，在 WB 中也会被检测出。此外有的目的蛋白会存在糖基化位点或其他修饰位点，条带大小可能会远超理论分子量。因而需求查阅文献或是 uniprot 来得知蛋白的剪切体大小以及修饰位点等。   五、背景过高   在局部 WB 结果中，条带之外本应是空白的背景也会有较深的颜色，对剖析结果会产生干扰，而且结果图不美观，难以用于文章发表。这种问题的可能缘由有以下几点： 23.封锁不充沛 背景过高的主要缘由之一是封锁有问题，倡议运用适宜的封锁剂（脱脂奶粉、BSA 等），优化反响浓度与封锁时间，同时留意防止呈现抗体与封锁剂的穿插反响，以及封锁剂与含有目的抗原，内源性生物素或者与抗生物素蛋白/链霉亲和素不相溶等问题； 24.洗膜不充沛 恰当增加洗膜次数弛缓冲液体积，进步吐温20的百分比可改善由洗膜不充沛招致的背景高的问题； 25.抗体的运用 一抗浓渡过高是高背景的缘由之一，且二抗也存在与封锁剂非特异性分离的可能，因而倡议恰当优化一抗浓度，并设二抗阴性对照； 26.曝光时间长 倡议在实验中采用适宜的曝光时间。   六、条带弥散或外形怪异   有时 WB 结果图中条带位置契合预期，但却由于条带弥散、外形怪异等要素招致无法运用，呈现这种状况多半是制胶或电泳过程出了问题，详细如下： 27.电泳时电压、电流过高 会招致条带迁移速率过快以及 SDS-PAGE 温度升高，并可能使得条带弥散、外形变形。倡议运用适宜的电泳条件并坚持低温； 28.电极不均衡 会招致条带偏斜，上样时在无样品的胶孔中参加等量样品缓冲液可防止这种状况； 29.上样量过高，样品中盐离子浓度较大 上样量过高可能会招致条带弥散，样品中的盐离子浓度不分歧则会招致条带不齐等问题。因而在上样时需保证样品量分歧且恰当，并坚持相同的、较低的盐离子浓度； 30.制胶问题 在配胶时一定要保证充沛混匀，平均凝胶，上样前用针头将胶孔拨正并吹出胶孔中的气泡。 31.电泳缓冲液寄存过久 电泳实验中的缓冲液假如放置过久也会对结果有不良影响，因而倡议及时改换新的缓冲液。   七、膜上分布不平均的污点   有时在 WB 做出结果后，除了目的条带以外，膜上还散布着不规律的污点，对结果也会有较大的干扰。这类问题产生的主要缘由有以下几点： 32.试剂、仪器等污染 倡议在每次实验前后留意清算实验仪器，同时及时改换呈现问题的试剂； 33.转膜时有气泡 确保在转膜过程中将气泡扫除洁净； 34.抗体孵育时与膜接触不充沛 确保在抗体孵育过程中，液体总量足够，同时将抗体平均配置，并在摇摆的条件下停止孵育； 35.曝光时间 过度曝光会招致斑点更明显，倡议采用适宜的曝光时间； 36.膜枯燥 实验中要保证有充沛的反响液，防止呈现干膜现象。   看完以上问题分析，大家是不是对这项“玄学实验”多了一些信心呢？大家可以对标下方贝茵莱生物抗体验证的实验结果图来检查自己的实验结果是否正常： 检查点 检查内容 PVDF膜 边缘整齐，无破损 背景 背景干净，偏浅灰色或者接近白色，无杂点 条带 条带边缘清晰，无明显拖尾或者弯曲，呈扁平状，同一大小条带在一条水平线上 Marker 各分子量大小条带位置间隔明显，颜色清晰可见